中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準

　　　出口禽肉中莫能菌素殘留量檢驗方法
　　　　　　　　　生物自顯影法 SN 0296一93
Method for the determination of monensin
residues in poultry meat for export
?Bioautography method
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1 主題內容與適用范圍
　　本標準規定了出口禽肉中莫能菌素殘留量的抽樣、制樣和生物自顯影測定法。
　　本標準適用于出口凍雞中莫能菌素殘留量的檢驗。
2　抽樣和制樣
2.1　檢驗批
　　以不超過2500件商品為一檢驗批。
　　同一檢驗批的商品應具有相同特征,如包裝、標記、產地、規格和等級等。
2.2　抽樣數量
　　　　　批量,件　　　　　　　　　　　　zui低抽樣數,件
　　　　　　　　1～25　　　　　　　　　　　　　　　　1
　　　　　　　26～100　　　　　　　　　　　　　　　　5
　　　　　　　101～250 10
　　　　　　　251～500 15
　　　　　　　501～1000　　　　　　　　　　　　　　　17
　　　　　　1001～2500　　　　　　　　　　　　　　　20
2.3　抽樣方法
　　按2.2規定的抽樣件數隨機抽取,逐件開啟。每件至少取一袋作為原始樣品,原始樣
品總量不少于2kg,放入清潔容器內,加封后標明標記,及時送交實驗室。
2.4　樣品制備
　　從每袋原始樣品中取出部分有代表性樣品,將可食部分放入高速組織搗碎機中搗碎均
勻,充分混勻,用四分法縮分出不少于1kg試樣。裝入清潔容器內,加封后標明標記。
2.5　樣品保存
　　將試樣于?18℃冷凍保存。
　　注：在抽樣及制樣過程中,必須防止樣品受到污染或發生殘留物含量的變化。
3　測定方法
3.1　方法提要
　　用甲醇提取肉樣中莫能菌素,經四氯化碳萃取后濃縮至干,以甲醇溶解殘留物,用薄
層分離,再用生物自顯影法測定。
3.2　設備和材料
3.2.1　微量注射器：50 μL。
3.2.2　薄層板：硅膠,Q/YT 257?85SG,5cm×20cm,使用前110℃活化2h。
3.2.3　展開缸：240mm×57mm×32mm。
3.2.4　游標卡尺：測量范圍0～200mm,精度0.02mm或使用抑菌圈測量儀測量。
3.2.5　離心機：轉速3000 r/min。
3.2.6　旋轉濃縮器。
3.2.7　恒溫培養箱：37±1℃。
3.2.8　高壓滅菌器。
3.2.9　長方形培養皿：20cm×10cm×5cm。
3.2.10 均質器：帶均質杯250mL。
3.3　試劑和培養基
3.3.1　試劑
3.3.1.1　甲醇：分析純。
3.3.1.2　四氯化碳：分析純。
3.3.1.3 乙酸乙酯: 分析純。
3.3.1.4　莫能菌素標準品: 960μg(效價)/mg(中國獸藥監察所提供)。
3.3.1.5　試驗菌種：枯草桿菌(Bacillus subtilis), 菌種號ATCC 6633(衛生部藥品生物
制品檢定所提供)。
3.3.2　培養基
3.3.2.1　菌種用培養基(見附錄A 第A1章)。
3.3.2.2　生物自顯影用培養基(見附錄A第A2章)。
3.3.2.3　肉湯培養基(見附錄A第A3章)。
3.4　測定步驟
3.4.1 工作液制備
3.4.1.1　莫能菌素標準貯備液
　　準確稱取適量的莫能菌素標準品,用甲醇溶解配制成濃度為500μg(效價)/mL的莫能
菌素標準溶液。配制后于冰箱中保存,一周內使用。
3.4.1.2　莫能菌素標準工作液
　　吸取標準貯備液,用甲醇分別稀釋成2,3,4,5,10和15μg(效價)/mL的標準工作
標準液。以上稀釋液均須當日配制。
3.4.1.3　菌種培養及芽胞菌懸浮液制備
　　將菌種安瓿瓶的上部消毒后敲碎,加入少量肉湯培養基,使其溶解并移至肉湯管中混
勻。置37±1℃溫箱中培養24h。將培養物接種于菌種培養基中,置于37±1℃培養一周,
鏡檢含芽胞菌數達85%以上, 便可制備芽胞懸浮液。
　　用適量滅菌生理鹽水沖洗菌苔,然后將該菌液轉移至離心管中,充分搖勻后,于3000
r /min離心30min, 棄去上清液,再加入同樣量的滅菌生理鹽水重復離心一次。棄去上清
液,再加入適量滅菌生理鹽水,搖勻后于65℃水浴中加熱30min,然后,于1000 r/min離
心5min, 取上清液并轉入滅菌試管中,即為芽胞菌懸浮液,置于冰箱中保存,可使用一個
月。
3.4.2　試液制備：準確稱取絞碎試樣10g(至0.1g)于均質杯中,加入20mL甲醇,均質
2min后,移入離心管中,于3000 r/min離心20min。取其上清液15mL,轉入盛有5mL蒸餾水
的250mL分液漏斗中,混合后加入10 mL四氯化碳,充分振搖,靜置分層,放出四氯化碳層
于150 mL茄形瓶中。用四氯化碳再重復提取兩次, 合并四氯化碳至上述茄形瓶中, 于50～
60℃水浴中用旋轉蒸發器濃縮至干,加入0.5mL甲醇溶解殘留物供TLC實驗用。此樣液中相
當于禽肉試樣濃度為15g/mL。
3.4.3　測定
3.4.3.1 生物自顯影
　　將每個樣品及標準溶液分別點在四塊薄層板上,先于每塊薄層板下端2cm處劃一條基
線,然后在這條基線上分別點20μL試液和3μg(效價)/mL莫能菌素標準溶液,試液和標準
溶液點相距2.5cm。在展開缸中用乙酸乙酯進行展開,直至溶劑前沿線距板頂端1.5cm處為
止,取出薄層板,風干后備培養用。
　　將薄層板水平置于高壓滅菌的長方形培養皿中,無菌操作將已熔化并冷卻至50～55℃
的生物自顯影用培養基均勻地噴在其表面上,然后用10mL上述接種芽胞菌懸液的培養基鋪
滿整個薄層板,保持水平,待其凝固,于37±1℃培養18 h。
3.4.3.2　對照試驗
　　除不加試樣外,按上述測定步驟進行。
3.5　結果計算和表述
　　經過培養后,在薄層板上與莫能菌素標準液產生抑菌圈的Rf值(約0.38)相同位置上,
顯現抑菌圈者即為陽性。
　　當樣品判定為陽性時,測量四塊薄層板上的試液及標準溶液產生的抑菌圈直徑,分別
計算出平均值。當每組四個直徑值的相對標準偏差(RSD)均不超過5%時,并且試液的抑菌
圈直徑與標準溶液(20μL)的抑菌圈直徑近似(直徑相差不超過±1mm),則其樣品中莫能菌
素含量按下式計算：
c
X＝──
m
式中：X??樣品中莫能菌素的含量,mg/kg；
　　　c??試驗中所用的標準溶液的濃度,μg/mL；
　　　m??zui終試液所代表的禽肉試樣的濃度,g/mL。
4　測定低限、回收率
4.1　測定低限
　　本方法測定低限為0.20mg(效價)/kg。
4.2　回收率
　　回收率的實驗數據:莫能菌素濃度在0.20～0.67mg(效價)/kg范圍內,回收率為81%～
100%。

附　錄 A　
　　　　　　　　　　　　　培養基成分及制備方法
　　　　　　　　　　　　　　　　 (補充件)
A1　菌種用培養基
　　　　　蛋白胨 10.0g
　　　　　牛肉浸膏 5.0g
　　　　　氯化鈉　　　　　　　　　 2.5g
　　　　　瓊脂 15.0g
　　　　　蒸餾水 1000mL
　　將上述各成分于蒸餾水中加熱溶解,用1mol/L氫氧化鈉溶液或10%鹽酸調節pH,使其
滅菌后pH為6.5±0.1,分裝于試管或克氏瓶內,于121℃ 15min高壓滅菌,滅菌后制備成
所需斜面備用。
A2　生物自顯影用培養基
　　　　　蛋白胨 10.0g
　　　　　酵母浸膏　　　　　　　　 2.5g
　　　　　葡萄糖 10.0g
　　　　　瓊脂 15.0g
　　　　　蒸餾水 1000mL
　　將上述各成分于蒸餾水中加熱溶解,用1mol/L氫氧化鈉溶液或10%鹽酸調節pH,使其
滅菌后pH為6.0±0.1,分裝于錐形瓶內,于121℃15 min高壓滅菌,備用。
A3　肉湯培養基
　　　　　蛋白胨 10.0g
　　　　　牛肉浸膏　　　　　　　　 5.0g
　　　　　氯化鈉　　　　　　　　　 2.5g
　　　　　蒸餾水 1000mL
　　將上述各成分于蒸餾水中加熱溶解,用1mol/L氫氧化鈉溶液或10%鹽酸調節pH,使
其滅菌后pH為7.0±0.1,分裝于試管中,于121℃15min高壓滅菌。

附錄 B　
　　　　　　　　　　　　　　　　檢驗程序圖
　　　　　　　　　　　　　　　　 (補充件)
試樣(10.0g) 試驗菌培養
┃┃
┃于均質杯內加入┃
┃ 20 mL甲醇┃
┃┃
均質2 min ┃
┃移入離心管┃
┃┃
離心20 min(3000r/min) 菌液制備
┃┃
取上清液(15 mL) ┃
┃轉入盛有5mL蒸餾生物自顯影用培養基
┃水的分液漏斗中┃
┃┃
┃┃
加入四氯化碳(10 mL) ┃
┃充分振搖后分取四氯化碳層┃
┃轉入茄形瓶中, 再重復兩次┃
┃┃
合并入上述茄形瓶中┃
┃┃
　　蒸干┃
┃┃
用0.5mL甲醇溶解┃
┃┃
層析┃
┃┃
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┃
培養
┃
┃
檢定
┃
┃
結果和表述

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附加說明:
　　本標準由中華人民共和國國家進出口商品檢驗局提出。
　　本標準由中華人民共和國天津進出口商品檢驗局負責起草。
　　本標準主要起草人袁而森、王素琴、李劍影。
　　本標準等同采用日本厚生省檢驗方法：畜水產食品中の殘留物質檢查法(1990)。
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中華人民共和國國家進出口商品檢驗局1993-12-28批準 1994-05-01實施